妳想知道的是瓊脂糖凝膠電泳
原理具有“分子篩”和“電泳”雙重功能。
瓊脂糖凝膠具有網狀結構,物質的分子通過時會受到阻力,大分子湧動時會受到很大阻力。所以在凝膠電泳中,帶電粒子的分離不僅取決於凈電荷的性質和數量,還取決於分子的大小,大大提高了分辨率。然而,由於其孔徑較大,其分子篩效應對大多數蛋白質來說可以忽略不計,現在廣泛用於核酸研究。DNA分子在瓊脂糖凝膠中遊動時具有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在等電點以上的pH溶液中帶負電,在電場中向正電極移動。由於糖-磷酸骨架的重復結構,相同數目的雙鏈DNA的凈電荷幾乎相同,因此它們可以以相同的速度向正極移動。
核酸分子是兩性離解分子。在其等電點以上的電泳緩沖液中,它們的堿基是不可分的,而所有的磷酸基團都是解離的,所以核酸分子帶負電荷,電泳時向正極遷移。也就是說DNA上有磷酸鹽,正常情況下是帶負電的,所以必然會往正方向移動。
1、膠水的制備和配制
第二,樣本
1,按照妳想要的量跑。例如:10μl樣品,4和6μl標記,用微量移液管小心地加入樣品槽中。
用微量移液槍小心地加入到樣品槽中,每次加入樣品後更換槍頭,防止相互汙染。加載樣品時註意小心操作,避免損壞凝膠或刺破樣品槽底部的凝膠。
第三,電泳
1.加入樣品後,關閉電泳槽的蓋子,並立即打開電源。控制電壓保持在110 V,電流在40 mA以上。橫向壓力運行
2.當條帶移動到離凝膠前沿約2 cm時(約40分鐘),停止電泳。
3.打開電腦和觀察儀器,在紫外線下拍照觀察。
註:PCR產物運行後可放入4℃冰箱保存。
備註:
1,凝膠厚度和孔徑
壹般來說,較厚的凝膠在操作過程中產生更多的熱量,這可能導致帶的擴散。由於凝膠染色的高背景或凝膠染色和/或脫色(如電泳後染色)所需的時間,可能會出現不良的可視化。對於瓊脂糖凝膠,厚度最好為3-4 mm,不推薦厚度超過5 mm的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的厚度由制造商提供的用於凝膠灌註的墊片決定。最常見的有0.75 mm,1.0 mm,1.5 mm..
由橡膠梳的形狀決定的孔徑不僅影響樣品加載,還影響測試條的分辨率。較大的孔雖然可以容納較大的樣品量,但也會產生較粗的條紋,會降低條紋的分辨率,產生色斑。然而,狹長的孔可以容納小樣品,但它可以提供更清晰的條帶,以獲得更好的分辨率。減少高密度樣品的進樣量可以提供更高的強度帶。
2、運行電泳時間
電泳時間短,不同長度片段的DNA條帶還沒有分離出來,只能看到DNA含量最高的主帶。但電泳時間較長,不同長度片段的DNA條帶已經分離,不同長度片段的DNA條帶可以清晰看到。
3.跑出來的DNA帶模糊了。