妳對ELISA實驗的註意事項了解多少
標本的收集和保存
通常，我們可以用於ELISA檢測的樣品類型有很多種，如血清、血漿、尿液、細胞培養上清液或組織勻漿等。不同類型的檢測樣品有不同的預處理方法。正確處理樣品是保證ELISA檢測正確性和準確性的第壹步。下面簡單介紹不同類型樣品的處理方法。
血清
血清是ELISA檢測最常用的樣品，其處理相對簡單。
用無熱原、無內毒素的試管或離心管采集血樣，將試管或離心管在室溫下放置2小時或4℃過夜，使血清沈澱。(最好將試管或離心管傾斜放置，增加液面橫截面，可以更大程度沈澱血清。)4℃1000×g離心20min，小心收集上清液。建議將血清分成多份保存在-20℃或-80℃下，避免反復凍融。
采血過程中應避免溶血，因為紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，HRP標記的ELISA檢測會出現非特異性顯色，導致檢測不準確。同時也要避免細菌汙染，因為細菌中可能含有內源性HRP，可能導致假陽性檢測。
血漿
用采血管或含抗凝劑的離心管采集血液樣本，采集樣本後30分鐘內4℃離心1000×g 15分鐘，取上清液作為血漿。將上清液分成多份，保存於-20℃或-80℃，避免反復凍融。避免使用溶血性或高脂血癥樣本。
常用的抗凝劑有EDTA、肝素鈉和檸檬酸鈉等。檢測時，還應仔細閱讀試劑盒說明書，檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。
細胞培養上清液
取細胞培養上清液至離心管，1000×g離心20min，去除細胞碎片和雜質，取上清液，保存於-20℃或-80℃下，避免反復凍融。
細胞裂解物
1)吸取培養板中的培養基，用胰蛋白酶消化細胞，加入適量培養基將細胞吹離培養板。懸浮細胞可以省略。
2)收集細胞懸液，1000×g離心10分鐘，棄去培養基，用預冷的PBS濕潤三次。
3)加入適量預冷的PBS或細胞裂解物(使用前加入蛋白酶抑制劑)以重新懸浮細胞。通常，6孔板的壹個孔中的細胞量需要150~250μL PBS來重懸。
4)將樣品置於-20℃或-80℃冷凍，再置於室溫解凍，反復冷凍數次，使細胞充分裂解。也可以通過超聲波破碎樣品，達到裂解的目的。
5)4℃離心10000×g 10分鐘，去除細胞碎片，取上清液，保存於-20℃或-80℃，避免反復凍融。
組織勻漿
1)用PBS (0.01M，PH 7.4)沖洗組織樣本，洗掉組織表面殘留的血液或雜質。
2)稱取組織塊，記錄並切成塊。碎片要越小越好，這樣才能均勻的更充分。
3)將組織按壹定比例加入預冷的PBS(使用前加入蛋白酶抑制劑)進行勻漿，勻漿時置於冰上或冰浴上。(通常組織重量:PBS體積等於1: 9，如1g組織樣本對應9mL PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，檢測後樣本濃度應乘以相應的稀釋倍數)。
4)將勻漿吸取至離心管中，4℃5000×g離心5~10min，取上清液，保存於-20℃或-80℃下，避免反復凍融。
尿液、唾液和其他液體生物樣本
用1000×g離心20min，取上清液檢測。
壹般來說，由於ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量，所以要保證所有樣品都是澄清的液體，要通過離心去除沈澱物或懸浮物。
為保證檢測的準確性，儲存於-20℃或-80℃的樣品應在1~6個月內進行檢測。儲存在4℃的樣品應在1周內進行檢驗。
此外，還要保證樣品中不含NaN3，因為NaN3會抑制HRP的活性，從而導致假陰性結果。
試劑的制備
按照試劑盒說明書的要求，準備好實驗所需的試劑。ELISA中使用的蒸餾水或去離子水，包括洗滌，應該是新鮮的高質量的。自制緩沖液和洗滌液用酸度計測量。從冰箱中取出的檢驗試劑應在溫度和室溫平衡後使用，室溫平衡壹般不少於30min。試劑盒中不需要的部分應及時放回冰箱保存。
加樣
在ELISA中，加樣壹般有三個步驟，即加樣、加酶結合物、加底物。加樣時，所加物質應加到雷薩板孔底，避免加到孔壁上部，註意不要溢出或產生氣泡。
標本壹般用微量取樣器加入，按規定量加入板孔。每次加樣都要更換吸嘴，避免交叉汙染，也可以用壹次性定量塑料管加樣(壹般不推薦)。有些指標(如間接ELISA)需要稀釋血清，可以在試管中按規定的稀釋度稀釋後再加樣。也可以在板孔中加入稀釋液，再加入血清樣本，然後在微型搖床上搖勻1min。添加酶結合物工作液和底物工作液時可使用多通道移液器，使加液過程在最短時間內完成。
熱絕緣
ELISA中壹般有兩個抗原抗體反應，即加入樣品和酶結合物後。抗原抗體反應的完成需要壹定的溫度和時間。這個保溫過程叫做孵化，也有人稱之為孵化。
ELISA是壹種固相免疫分析，抗原和抗體的結合只發生在固相表面。以抗體包被的夾心法為例。加入板孔的樣品中，並非所有抗原都有均等的固相抗結合機會，只有最靠近孔壁的那層溶液中的抗原與抗體直接接觸。這是壹個逐漸平衡的過程，所以需要擴散才能達到反應的終點。酶標抗體與固相抗原的結合也是如此。這就是為什麽ELISA總是需要壹定時間的孵育。
孵化常用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)。37℃是實驗室常用的溫度，也是大多數抗原和抗體結合的適宜溫度。建立ELISA方法研究反應動力學時，兩種抗原抗體反應在37℃下通常需要1-2小時，產物可達峰值。為了加速反應，可以提高反應溫度。有些實驗在43℃下進行，但更高的溫度是不合適的。抗原和抗體在4℃反應更徹底，放免檢測中反應往往在冰箱中過夜，形成最多沈澱。但由於耗時太長，壹般不用於ELISA。
除了壹些帶有專用電加熱塊的ELISA儀器外，壹般采用水浴保溫。酶標板可以放在水浴箱中，酶標板的底部要貼在水面上，這樣可以快速平衡溫度。為了避免蒸發，要把板蓋上，板的孔也可以用塑料密封紙或保鮮膜蓋住，使反應板浮在水面上。如果使用培養箱，酶標板應放在濕盒中。濕箱要用金屬等導熱性好的材料制作，箱底要墊濕紗布。最後，酶標板要放在濕紗布上。濕箱要在培養箱裏預熱到規定的溫度，尤其是溫度低的時候。為了避免酶標板底部水汽或磨損造成讀數誤差，壹般用鼓風機恒溫保溫。在這個過程中，必須在酶標板上方粘貼紙張，避免蒸發。無論是水浴還是濕箱孵育，反應板都不要疊放，以保證每塊板的溫度能快速平衡。對於室溫孵育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的範圍內。標準室溫是指20-25℃，但具體操作可根據說明書要求控制。在室溫下孵育時，酶標板只能平放在操作臺上。需要註意的是，孵化的溫度和時間要按照規定盡量準確。為了保證時間準確，壹個人不要同時操作和測量兩塊以上的板。
洗滌
雖然洗滌不是ELISA中的反應步驟，但也決定了實驗的成敗。ELSIA可以通過洗滌分離遊離和結合的酶標記。通過洗滌，去除了殘留在板孔中的不能與固相抗原或抗體結合的物質以及在反應過程中非特異性吸附在固相載體上的幹擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍的，洗滌時要洗掉這種非特異性的吸附幹擾物質。可以說，洗滌是ELISA操作中最重要的關鍵技術，應引起操作人員的高度重視，嚴格按照要求進行洗滌，不可馬虎。
除了壹些ELISA儀器配有專門的自動洗滌儀器外，還有兩種洗滌方式:浸泡和流水洗滌。流程如下:
(1)浸沒式:a .吸收或甩幹孔中的反應溶液；b .用洗滌液過洗(洗滌液灌滿板孔後，扔掉)；c)浸泡，即將板孔註滿洗滌液，靜置1-2min，間歇搖動，浸泡時間不能隨意縮短；吸幹洞裏的液體。吸要徹底，可以用水泵或真空泵吸，也可以在液體倒掉後用幹凈的毛巾或吸水紙拍幹；e .重復操作c和d，洗滌3-4次(按照說明中的規定)。在間接法中，如果背景高，可以增加洗滌次數或浸泡時間。
浸泡洗滌法常用於微量滴定板。洗滌液主要是含有非離子洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體和蛋白質的結合是疏水的。非離子去汙劑既含有疏水基團又含有親水基團，其疏水基團通過疏水鍵與蛋白質的疏水基團結合，從而削弱了蛋白質與固相載體的結合。借助親水基團和水分子的結合，蛋白質恢復到水溶液狀態，從而與固相載體分離。洗滌液中的非離子型洗滌劑壹般為吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間。當高於0.2%時，包被在固相上的抗原或抗體會被解吸，從而降低測試的靈敏度。
(2)流水沖洗法:流水沖洗法最初用於清洗珠載體，洗滌液僅為蒸餾水甚至自來水。洗的時候附壹個特殊的裝置，讓珠子在流水的沖擊下不斷滾動。連續沖洗2分鐘後，將液體瀝幹，然後在蒸餾水中浸泡2分鐘，然後瀝幹。浸泡就像洗澡，流水沖洗就像淋浴。其洗滌效果更徹底，簡單快捷。現有的實驗表明，流水洗滌也適用於洗滌微量滴定板。清洗時盡量加大水流或水壓，使水流沖擊板孔表面，清洗效果更好(這種方法在套件中很少使用)。
顯色和色度學
著色
顯色是ELISA中最後的孵育反應，此時酶催化無色底物產生有色產物。反應溫度和時間仍然是影響顯色的因素。在壹定的時間內，陰性毛孔可以保持無色，而陽性毛孔隨著時間的推移會變得更有顏色。適當提高溫度有助於加速顯色。定量測定時，加入底物後的反應溫度和時間應盡可能準確。定性測定的顯色可在室溫下進行，時間壹般不需要嚴格控制。有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況，適當縮短或延長反應時間，以便及時判斷。
壹般OPD底物在室外溫度或37℃下反應20-30分鐘後顯色不會加深，延長反應時間背景值會增大。OPD的底物溶液遇光會自行變色，顯色反應要在暗處進行。在顯色反應結束時，通過加入終止溶液來終止反應。在OPD產物用硫酸終止後，顏色從橙色變為棕色。
TMB不受光的影響，所以它可以在室溫下放在手術臺上，反應時可以觀察結果。但為了保證實驗結果的穩定性，宜在適當的時候讀取結果。TMB經HRP處理後，40分鐘左右顯色達到高峰，隨後逐漸減弱，2小時後完全消失至無色。TMB的終止溶液有很多種，疊氮化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑可以終止反應。這種終結者可以長時間保持藍色(12-24小時)，是視覺判斷的好終結者。此外，各種酸性終止液都會由藍色變為黃色，此時可在特定波長(450nm)下測得吸光度。
【化學】色度的……
比色前要用幹凈的吸水紙吸幹附著在板底部的液體，但盡量避開表面，然後將板正確放置在酶標比色計的比色架上。以軟板為載體的實驗，要把板放在標準的96孔臺座上，才能進行比色。最好在加入底物溶液顯色前，將軟板的邊緣切掉，使板完全坐入座架內。
比色時，先用蒸餾水校準零點，測量並讀取底物孔(只加入底物液而不發生任何反應的孔)和空白孔(全程用生理鹽水或稀釋液代替樣品的孔)，記錄本次試驗的試劑狀態。之後可以用空白孔用蒸餾水校準零點，用空白孔的吸光度減去上述孔的吸光度，然後計算。
比色結果的表達以前是光密度(OD)，現在按規定用吸光度(A)，意思壹樣。通常的表示方法是將吸收波長寫在字母a的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為“A492nm”或“OD492nm”。
酶標記比色計
酶標比色儀，簡稱酶標儀，通常是指專用於測量ELISA結果吸光度的光度計。根據固體載體的不同形式，有適用於平板、珠子和小試管的特殊設計。很多試劑公司供應酶標儀器。酶標儀的主要性能指標有:讀數速度、讀數準確度、重復性、準確度和可測範圍、線性度等。壹個優秀的酶標儀的讀數壹般可以精確到0.0 01，準確度1%，重復性0.5%。例如，如果某孔的實測A值為1.083，則該孔相對於空氣的真A值應為1.083 0.01(1.073 ~ 1.093)，重復測量後其A值應為1。酶標儀的可測範圍因每臺酶標儀的性能而異。壹般的酶標儀是0.000~2.000，新的酶標儀上限被拉大到2.900甚至更高。超過可測量上限的值通常用“*”或“超過”或其他符號表示。我們要註意可測範圍和線性範圍的區別，後者往往小於可測範圍。比如壹個酶標儀的可測範圍是0.000~2.900，而它的線性範圍只有0.000~2.000，這是定量ELISA做標準曲線時要註意的。
酶標儀不應放置在陽光下或強光下，操作時室溫應在15~30℃。使用前將讀數器預熱15-30分鐘，這樣讀數結果會更穩定(部分酶標儀說明書明確註明不需要預熱)。
讀取A值時，應選擇產品靈敏的吸收峰，如波長為492nm的OPD。有些酶標儀可以使用雙波長讀數，即每個孔讀兩次，第壹次在最佳波長(W1)，第二次在不敏感波長(W2)，兩次測量之間酶標板的位置不移動。比如OPD用492nm作為W1，用630nm作為W 2，最後測得的A值就是兩者之差(W1-W2)。雙波長讀取可以減少容器上的劃痕或指紋造成的光學幹擾。
各種酶標儀器的性能不同，使用時記者的說明要詳細。
結果判斷
定性測定
定性判定的結果是對被檢標本是否含有待檢抗原或抗體給出“是”或“否”的簡單回答，分別用“陽性”和“陰性”表示。“陽性”表示樣本在測定系統中有反應。“否定”表示沒有反應。定性判斷也可以得到半定量的結果，即用效價來表示反應的強度，本質上還是定性檢驗。在這種半定量測定中，將樣品進行系列稀釋並進行檢測，陽性反應的最高稀釋度為效價。根據滴度可以判斷樣本的反應性，這比觀察未稀釋樣本的顏色深淺來判斷是強陽性還是弱陽性更具有定量性。
在間接法和夾心法ELSIA中，正孔的顏色比負孔的顏色深。相反，在競爭ELISA中，陰性孔的顏色比陽性孔的顏色深。兩種反應的結果以不同的方式判斷，如下所述。
(1)間接法和三明治法
這類反應的定性結果可以用肉眼判斷。如果目測標本無色或接近無色，則判定為陰性，如果顏色清晰，則為陽性。但在ELSIA中，正常人血清反應後常出現壹種有色背景，這種背景的深淺隨試劑組成和實驗條件而異，所以實驗中必須加入陰性對照。陰性對照的成分應為正常血清或不含受試物質的類似物。用肉眼判斷結果時，用比陰性對照暗的顏色作為標本的陽性指標更為合適。
目測法簡單明了，但相當主觀。在條件允許的情況下，用色度計測定吸光度值，這樣可以得到客觀的數據。首先讀出樣品(S)、陽性對照(P)和陰性對照(N)的吸光度值，然後計算。計算方法很多，大致可分為兩類:陽性判定值法和標本與陰性對照比值法。
A.積極判斷值
壹般陽性臨界值是陰性對照A值加上壹個特定的常數，作為判斷結果是陽性還是陰性的標準。
用這種方法判斷結果，要求實驗條件非常恒定，試劑的配制必須規範，正負對照品要符合壹定的規範，必須使用精密儀器，嚴格按照規定操作。陽性判定值公式中的常數是通過對這壹特定體系中大量標本的實驗檢測得到的。我們以檢測HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復鈣人血漿，陽性對照品中HBsAg的含量標註為P = 9±2 ng/ml。每個實驗有2個陽性對照和3個陰性對照。測量A值後，首先計算陰性對照A值(NC X)的平均值和陽性對照A值(PCX)的平均值，兩個平均值之差(P-N)必須大於特定值(例如0.400)測試才有效。三個陰性對照的a值應≥0.5×NCX且≤1.5×NCX。如果其中壹個超出此範圍，則應將其丟棄，並使用另外兩個陰性質控品重新計算ncx。如果兩個陰性對照的壹個值超過上述範圍，實驗無效。根據以下公式計算陽性判斷值:
正面判斷值=NCX+0.05
A值大於陽性判斷值的標本為陽性，A值小於陽性判斷值的標本為陰性。需要註意的是，公式中的0.05是試劑盒的常數，只適用於這種特定的條件，並不通用於各類試劑。
根據以上描述，可以看出，陰性對照和陽性對照在該方法的檢驗質量控制中也發揮作用，試劑變質和操作不當都會導致“檢驗無效”的後果。
B.樣本/陰性質控比率
當實驗條件(包括試劑)難以保證恒定時，這種判斷方法更為適用。獲得樣本和陰性對照的A值後，計算S/N值。還有人寫P/N，這裏P不是代表陽性，而是patient的縮寫，不要誤解。為了避免混淆，用s/n更合適，在早期的間接ELISA中，有作者將S/N定為陽性標準，現在常用於各種檢測。事實上，每個測量系統都應該通過實驗找到自己的信噪比閾值。應當註意，用n表示的陰性對照是不含受試物質的人血清。某些試劑盒中的陰性對照是不含蛋白質或含蛋白質的緩沖液，因此反應後產生的背景可能比正常人血清低得多。因此，這樣的試劑盒規格，如N
(2)競爭法
競爭法ELISA中，陰性孔的顏色比陽性孔的顏色深。負顯色的強度取決於酶綴合物的濃度和反應中加入的競爭抑制劑的量。壹般陰性對照的吸光度調整在1.0-1.5之間，此時反應最靈敏。
競爭ELISA不太容易通過自身觀察判斷結果，因為肉眼很難分辨弱陽性反應和陰性對照的顏色差異，壹般通過比色計讀出S、P、n的吸收值來確定，主要有兩種計算方法，即陽性判斷值法和抑制率法。
A.正判斷值法
與間接法和夾層法中的陽性判定值法基本相同，只是在計算公式中引入了陽性對照A值。現在以檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗-HBc的復鈣人血漿，陽性對照中抗-HBc含量為125 100u/ml。每個實驗有2個陽性對照和3個陰性對照。測量A值後，首先計算陰性對照A值(NC X)的平均值和陽性對照A值(PCX)的平均值，兩個平均值之間的差值(N-P)必須大於特定值(例如0.300)，測試才有效。三個陰性對照的a值應小於2.000，且應≥0.5×NCX且≤1.5×NCX。如果其中壹個超出此範圍，則應丟棄，並用另外兩個陰性對照重新計算× ncx。如果有兩個陰性對照A超出上述範圍，實驗無效。根據以下公式計算陽性判斷值:
否定判斷值=0.4×NCX+0.6×PCX
a值≤正判斷值的反應為正，a >正判斷值的反應為負。
B.抑制率法
抑制率表示競爭性結合中陰性反應顯色的抑制程度，計算如下:
抑制率(%) =(陰性對照A值-標本A值)×100%/陰性對照A值。
壹般來說，抑制率≥50%為陽性，< 50%為陰性。
定量測定
ELSIA的操作步驟復雜，影響反應的因素很多，尤其是固體載體的包衣很難達到個體間的壹致性。因此，在定量測定時，每批試驗必須用壹系列不同濃度的參考標準在相同條件下制作標準曲線。測定高分子量物質的夾心ELISA壹般有較寬的標準曲線範圍，曲線最高點的吸光度可接近2.0。繪圖時常用半對數紙，以被測物質的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，將各濃度值逐點連接。得到的曲線壹般呈S形，其頭尾曲線趨於平緩，中間的直線部分是最理想的檢測區域。
競爭法常用於測定小分子量物質，其標準曲線中的吸光度與被測物質的濃度呈負相關。由於試劑盒中使用的型號不同，標準曲線的形狀略有不同。