高速逆流色譜儀的相關原理
高速逆流色譜是壹種基於單向流體力學平衡體系的逆流色譜分離方法，是在研究旋轉管流體力學平衡時偶然發現的。當螺旋管低速旋轉時，螺旋管中的兩相從壹端分布到另壹端。當壹相作為流動相從壹端向另壹端洗脫時，另壹相在螺旋管中的保留值約為50%，但這種保留會隨著流動相流速的增加而降低，從而降低分離效率。然而，當螺旋管的旋轉速度加快時，兩相的分布發生變化。當轉速達到臨界範圍時，兩相將沿螺旋管長度方向完全分離，其中壹段占據頭端的壹段，稱為頭端相，另壹段占據尾端的壹段，稱為尾端相。高速逆流色譜利用了這種兩相的單向分布。在螺旋管的高轉速下，如果第壹相從尾端進料，它將穿過尾端並移至首端。同樣，如果從頭端饋入，它將通過第壹階段，並移動到螺旋管的尾端。在分離過程中，首先將其中壹種相(固定相)註入螺旋管，然後從合適的壹端泵出流動相，這樣它就可以攜帶樣品在螺旋管中進行無限分布。儀器轉速越快，保留的固定相越多，分離效果越好，分離速度大大提高，故稱高速逆流色譜。
2.高速逆流色譜儀的基本配置
儀器的中心部分:(a) ITO多層線圈分離柱，由100-200m長，內徑約1.6mm的聚四氟乙烯管沿適當內徑的內軸纏繞十余層，管內總容積可達300mL左右。(b)平衡器，可以調節重量，其作用是相對於中心軸平衡兩側(a)和(b)的重量。當(a)和(b)在旋轉控制器的控制下，在齒輪傳動裝置的作用下，繞中心軸線作順時針或逆時針的行星運動時，即(a)- (b)都在旋轉，但同時又在繞中心軸線公轉，公轉速度可以是0 ~ 4000轉/分。線圈的兩端通過中空的中心軸同時從線圈分離柱中抽出，壹端用於抽取液體，另壹端用於輸出液體。儀器需要兩種不相溶的液體，壹種作為固定相，另壹種作為流動相。儀器工作前，液體作為固定相的第壹相被恒流泵壓入線圈分離柱，然後被進樣器註入待分離的樣品，如圖所示，最後流動相被恒流泵壓入，同時中心部分開始運轉，直到轉速大於600r/min。此時，兩相在線圈分離柱中具有相對運動的可能性。由於流動相的持續壓力，阻止了固定相的流出，同時流動相攜帶樣品在盤管分離柱中進行無限分配，使復雜樣品得以分離。當流動相通過檢測器時，由於不同的樣品組分會產生不同的信號，所以可以用記錄儀得到逆流色譜圖，用餾分收集器逐級收集流動相可以得到復雜樣品的分離組分。大型制備型HSCCC，柱體積可達530m1，最大進樣量可達20g粗品；更小的分析型HSCCC柱體積為8m1，進樣量為幾十微克，最大轉速可達4000r/min，分析能力與HPLC相當。
在常用的HSCCC基礎上，提出了雙模式高速逆流色譜(簡稱Dccc)，即以前壹個流動相作為下壹個固定相，洗脫方向相反。與傳統的高速逆流色譜相比，直接逆流色譜無需預測溶質的保留時間和分配系數，可減少制備時間，消除洗柱時間，提高分離效率，降低溶劑選擇的復雜性。但目前由於溶劑體系不完善，應用範圍較窄。
三、高速逆流色譜的技術特點
1.適用範圍廣，適應性好。
由於溶劑體系的組成和配比可以無限大，理論上可以應用於任何極性範圍的樣品分離，在分離天然化合物方面有其獨特性。由於聚四氟乙烯管中的固定相為液體，不需要固體載體，因此可以消除固液色譜中使用固體載體造成的吸附損失，特別適用於分離極性物質。
2.操作簡單，容易掌握
儀器操作簡單，對樣品前處理要求低，可以制備、分離或分析壹般的粗提物。
3.高回收率
不需要固體載體，消除了樣品在固體載體上的不可逆吸附和降解造成的損失，理論上樣品回收率可以達到。只要在實驗中調整分離條件，壹般都有較高的回收率。
4.良好的再現性
如果樣品沒有很強的表面活性和很弱的酸堿性，即使多次進樣，其分離過程仍然保持很穩定，重現性相當好。
5.分離效率高，分離量大。
由於它不同於壹般的色譜分離方法，可以實現梯度洗脫和反相洗脫，還可以進行重復進樣，因此特別適用於制備分離，產品純度高，制備量大。
6.分配系數
溶劑體系的選擇是在色譜分離過程中同時選擇兩相，這是樣品成功分離的關鍵，而樣品中各組分的分配系數決定了這種溶劑體系是否合適，所以分配系數的測定是溶劑體系選擇的重要環節。目前，分配系數的測定方法主要有薄層色譜法、毛細管電泳法、高速逆流色譜、生物活性分配比法和分析法。
7.溶劑體系和溶液體系待分離物質類型基本兩相溶劑體系輔助溶劑非極性或弱極性物質正庚基(己烷)烷烴-氯甲烷正庚基(己烷)烷烴-甲醇(或乙酸乙酯)-氯甲烷中極性物質氯仿-甲醇、正丙醇、乙基異丙醇-正己烷、甲醇、極性物質正丁醇-甲醇、乙酸高速逆流。
上表根據被分離物質的極性列出了壹些基本的溶劑體系供參考，包括非水體系和水體系。
溶劑系統的選擇對分離高速逆流色譜至關重要。遺憾的是，到目前為止，溶劑體系的選擇還沒有充分的理論依據，而是建立在實踐中積累的豐富經驗的基礎上。壹般來說，溶劑體系應滿足以下要求:溶劑體系不會引起樣品的分解或變性，樣品中各組分的分配系數壹般認為在0.2-5的範圍內，各組分的分配系數值應充分不同，分離因子大於等於1.5；溶劑系統不會幹擾樣品的檢測；為保證固定相保留率不低於50%，溶劑體系分層時間不得超過30秒；上下兩相的體積比合適，避免浪費溶劑；盡量使用揮發性溶劑，方便後續處理，盡量避免使用有毒溶劑。根據溶劑體系的極性，可分為弱極性、中等極性和強極性三類。經典的溶劑系統包括正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水。實驗中要根據實際情況，總結、分析、參考相關專著和文獻，從待分離物質的種類中尋找相似的分離實例，選擇極性合適的溶劑體系，調整各種溶劑的相對比例，確定目標組分的分配系數，最終選擇合適的溶劑體系。
第四，高速逆流色譜的應用
我國是世界上最早研究逆流色譜技術的國家，其應用範圍非常廣泛，如生物工程、醫藥、天然產物化學、有機合成、環境分析、食品、地質、生化、醫藥、農業、環境、材料、化工、海洋生物、無機離子、保健品原料、食品添加劑、化妝品等。
1.天然產物
HSCCC可采用不同理化特性和多種操作條件的溶劑體系，適應性強，為從復雜的天然產物中提取不同特性(如不同極性)的有效成分提供了有利條件。因此，在20世紀80年代後期，在世界範圍內回歸自然的浪潮下，高速逆流色譜被廣泛應用於天然產物化學成分的分析、制備和分離，並且被報道的最多。
例如，用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(3∶7∶5∶5)分離粉防己幹燥根的粗提物；紅豆杉粗提物用正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水(6: 3: 2: 5)或正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1: 1: I: I)分離。石油醚(40-60℃)/乙酸乙酯/甲醇/水(50: 70: 80: 65)體系適用於紫杉醇混合物的分離。用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(3: 7: 5: 5)可以有效地分離肉桂酸、阿魏酸和咖啡酸的混合物。紫杉醇和caphalornannine用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/乙醇/水(5: 7: 5: 1: 1.5)分離。氯仿/0.07摩爾/升磷酸鈉0.04摩爾/升檸檬酸緩沖體系(pH:
5.08，1: 1)馬錢子堿和士的寧的分離制備；用氯仿/甲醇/丙酮/水(5∶6∶1∶4)分離挪威雲杉針葉的粗提物；雜交番茄枝籽粗提物用正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水(3: l0: IO: 7)分離，下相壹般作為流動相。
此外，還有用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(7-epi-10-脫乙酰基紫杉醇1)等兩步分離紫杉醇同系物的例子。第壹步是(1: 1: 1: 660)。另外，采用多維高速逆流色譜(多維高速逆流色譜)連續分離制備異鼠李素和4，5，7-三羥基黃酮醇槲皮苷，采用氯仿、甲醇/水(4: 3: 2)體系J。總之，HSCCC對天然產物的分離制備非常適用，不僅適用於極性化合物，也適用於非極性化合物；它不僅可以用來去除天然產物粗提物中的雜質，還可以用來精制最終產品，甚至可以壹步得到純品。當分析型高速逆流色譜的儀器速度在2000轉/分以上且溶劑系統合適時，分離速度可與高效液相色譜相當。
中藥來源於天然植物或動物，HSCCC也可用於分離單味中藥的有效成分或方劑的有效部位。例如何首烏的氯仿提取物。用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1: 1: 1)和氯仿/甲醇/水(4: 3: 2)分離得到大黃素和光敏色素，分離醇提物得到654。何首烏甲醇提取物用乙酸乙酯/甲醇/水(50: 1: 50)分離，下相作為流動相。用氯仿/甲醇/0.1 mol/L鹽酸(4: 1.5: 2)分離制備黃連生物堿，下相為流動相。當歸提取物用R134a/甲醇/水體系分離，流動相為RliM-a，固定相為甲醇/水(65: 30或70: 30)。用氯仿/甲醇/水(4: 3: 2)分離銀杏葉提取物，得到4，5，7-三羥基黃酮醇、異鼠李素和槲皮苷純品。總之，HSCCC在中藥方劑的分離制備方面還是壹個空白，開展該領域的HSCCC工作意義重大。
2.抗生素
由於粗品可直接送入高速逆流色譜，高速逆流色譜也用於抗生素的分析、制備和分離。樣品體積為1 mg-5 g。
通常，疏水系統可用於分離抗生素。對於未知樣品，強極性組分是含正丁醇的體系，中等疏水性組分是含氯仿的體系，疏水性組分是含正己烷的體系。例如，用氯仿/氯乙烯/正己烷/甲醇/水(1: 1: 35: 1)體系分離柔紅黴素衍生物，上相作為流動相。以苯/氯仿、甲醇/水(15: 15: 23: 7)分離埃洛黴素(Na in)混合物，進樣量為100mg，上相為流動相。用乙醚和甲醇/水(5: 1: 4: 5)分離放線菌素(肌動蛋白，靜脈)～(2+)復合物。註射量達到83 mg，上相用作流動相。氯仿/甲醇/水(4: 4: 3)體系用於分離氯己定衍生物。註射量為100 mg，上相用作流動相。用四氯化碳/甲醇/0.01 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH = 7) (2: 3: 2)分離Niddamycins混合物。註射量為65438±000mg；；伊維菌素用正己烷/L乙酸乙酯、甲醇/水(19: 1: LO: LO)分離，進樣量25 mg，下相為流動相。用氯仿/乙酸乙酯/甲醇/水(3: 1: 3: 2)分離普那黴素等。
3.蛋白質和肽
高速逆流色譜分離制備蛋白質或多肽混合物的最新進展主要取決於以下三個因素:(1)采用低粘度溶劑體系，其中大部分含有正丁醇；新型pH帶萃取逆流色譜的出現和發展:高速逆流色譜和離子對逆流色譜的綜合應用。後兩種逆流色譜技術將在下面詳細描述。如桿菌肽用氯仿/苯/甲醇/水(15: 15: 23: 7)分離，進樣量可達100 mg，以上相為流動相；用氯仿/乙醇/水(5: 4: 3)或氯仿/乙醇/甲醇/水(5: 3: 3: 4)進行分離，註射量可達50mg。用正丁醇/0.03摩爾/升三氟乙酸(1: 1)分離粘桿菌素；使用正丁醇/二氯乙酸/0.1 mol/L甲酸銨(1: O.O1: 0.01)、叔丁基甲基醚/乙腈/三氟乙酸(0.5%-5%) (2: 2: 3)和叔丁基甲基醚/乙腈/三氟乙酸。用正丁醇/0.2摩爾/升甲酸銨(pH:8.5)(1:1.5℃)或正丁醇/0.2摩爾/升甲酸銨(pH = 9) (1: 1)分離膽囊收縮素。
4.食物
HSCCC在食品分離中最大的優勢是可以直接進樣粗或復雜的樣品，壹般用於食品解毒或生物活性物質的制備。比如通過HSCCC檢測食物中毒素的含量，分離出SEA(壹種引起食物汙染的常見毒素)[28]；用正己烷/乙腈/叔丁基甲基醚(10: 10: 1)從芹菜中分離Falcarind和Falcarindiel[29]；糖和PNP衍生物用HSCCC正交螺旋管行星離心法分離，溶劑系統為正丁醇/乙酸/水(4∶1∶5)或正丁醇/甲醇/水(4∶1∶4)。在分離體系中，通過衍生化可以增加分子的疏水性，從而實現分離。
5.無機物
高速逆流色譜在分離無機物中的應用主要集中在稀土元素或重金屬元素。如以混合的0.5mol/lα(磷酸二乙基己酯)和十二烷為固定相，鹽酸為流動相，富集稀有元素；用鹽酸和氯仿(溶於0.15 mol/L的Depha) (1: 1)分離鑭系元素Sm、Gd、Tb、Dy、Er、Yb，效果良好。以EHPA(乙基己基磷酸酯)和單-2-乙基己基醚的甲苯溶液體系為固定相，含鈥、鉺等鑭系元素的溶液(相當於流動相)從頂部洗脫，金屬元素在固定相中富集。發現稀土元素絡合物的保留值與流動相的pH值有很大關系。隨著pH值的增加，保留體積增加，但理論塔板數減少。此外，在流動相中，根據上述方法，HSCCC可用於環境分析、檢測或汙染控制。雖然靈敏度較低，但固定相可以富集幹擾金屬離子。
6.其他人
隨著技術的發展，高強混凝土的應用範圍逐漸擴大。已經嘗試用高速逆流色譜拆分外消旋化合物。例如，N-十二烷基-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺已成功用於氨基酸衍生物的分離。有人用高速逆流色譜分離紫膠染料。溶劑體系為叔丁基甲醚/正丁醇/乙醇/水(2∶2∶1∶5)，所得物質的純度約為95%。馬和伊藤發現，增加有機固定相中手性選擇性試劑的含量，增加溶劑體系的疏水性，可以提高色譜峰的分辨率。
動詞 （verb的縮寫）高速逆流色譜的展望
近年來，溶劑體系的選擇範圍越來越廣。有人建議利用超臨界二氧化碳的高擴散性、低粘度、流體特性和環境友好性等無可比擬的優勢，將其用作分離化合物的流動相，也有人建議使用制冷劑作為流動相。也有人提出，三相溶劑體系可用於高速逆流色譜分離，能很好地分離極性範圍較寬的樣品。目前，三相溶劑僅用於標準混合物的分離，而不用於特定天然產物的分離。相信進壹步開發將在復雜天然產物和藥物的分離中有很大的應用前景。
PH帶逆流色譜是壹種新發展的制備色譜技術，可以將樣品的上樣量提高10倍以上，即使是含量非常低的物質也可以得到高度濃縮。壹對試劑-保留劑和洗脫劑被添加到固定相和流動相中。保留劑用於將樣品中的組分保留在色譜柱中。當含有洗脫液的流動相以壹定流速通過固定相時，由於酸堿反應最終達到平衡。用保留劑在兩相中的濃度比來標定保留劑的分配系數，溶質的分配系數與標定值之差決定溶質的出峰時間，根據不同組分的Pka和疏水性的不同來實現分離。它的色譜峰以高度集中的矩形峰的形式壹個接壹個連接起來，重疊很少，很像交替色譜的色譜峰。
離子對逆流色譜是在固定相中加入適當的配體，提高溶質在固定相中的保留值，提高峰的分辨率。它已廣泛應用於天然藥物中多肽、生物堿和氨基酸的分離。
雙模式逆流色譜(簡稱DuCCC)是指兩相同時從螺旋管兩端流入，從相應的端口流出，兩相形成真正的逆向對流。與常規HSCCC相比，DuCCC具有更快的分離速度和更高的分離效率，且無需預測溶質的保留時間和分配系數，降低了溶劑選擇的復雜性。這項技術可以應用於蛋白質分離。
HSCCC與質譜等其他技術的結合也是目前的研究熱點，將HSCCC分離的多樣性與質譜的高靈敏度檢測和結構分析特性結合起來，具有非常廣闊的前景。為了克服高速逆流色譜理論研究的相對落後，許多研究者從事理論研究，試圖建立完善的理論基礎來指導溶劑體系的選擇，以使高速逆流色譜盡快從壹門分離技術發展成為壹門分離科學。
HSCCC是壹種獨特的無固體載體液-液分配色譜技術，是壹種實用的分離制備技術，可以實現連續有效的分離。可以使用多種溶劑體系分離任意極性範圍的樣品，可以實現從微克、微升到數百毫克、克的制備和純化的分析分離。適用於大量未經嚴格處理的粗樣品的中間分離，也可配合質譜儀、紅外光譜儀等分析儀器進行高純度分析。具有非常廣闊的應用前景。