卵清蛋白(OVA)和BSA表面的氨基數是多少？
我做過小分子和蛋白質的偶聯，我自己總結過壹些。您可以參考以下內容:
人工抗原合成的常用載體
載體表面首先要有化學活性基團，可以直接偶聯抗生素或農藥，這是化學偶聯制備抗原的前提。其次，載體要有壹定的容量，能耦合足夠多的分子；載體也應該是惰性的，並且不應該幹擾偶聯分子的功能；此外，載體應該具有足夠的穩定性，並且應該便宜和容易獲得。
常用作合成人工抗原載體的蛋白質包括牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、匙孔血藍蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)和合成多聚賴氨酸(PLL)。在這些蛋白質分子中，α和ε-氨基(等電點8和10)、酚基、巰基(等電點9)、咪唑基(等電點7)、羧基(等電點2 ~ 4，多來自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基)等。，在等電點pH條件下，它們中的壹部分變成質子，另壹部分變成質子。當然，這些基團的反應性也取決於蛋白質中各種氨基酸殘基的微環境。牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HAS)含有大量的賴氨酸，因此有許多遊離氨基，在不同的pH和離子強度下都能保持較大的溶解度。此外，當這些蛋白質溶解在有機溶劑(如吡啶和二甲基甲酰胺)中時，它們活性基團仍然是可溶的。因此，這兩種蛋白質是最常用的蛋白質載體[30]。近年來有報道稱合成肽(最常用的是多聚賴氨酸)可以增加半抗原的免疫原性，從而增加產生針對半抗原的特異性抗體的可能性，已被廣泛應用[31，32]。
1.2.2人工抗原的合成方法
小分子半抗原與載體蛋白的偶聯效果會受到偶聯物的濃度和相對比例、偶聯劑的有效濃度和相對量、緩沖溶液的組成和純度、離子強度、pH、穩定性、溶解性以及半抗原的理化特性等因素的影響。半抗原通常在溫和的水溶液中與載體蛋白的價態結合，不適合高溫、低溫、強堿和強酸。通常偶聯的方法由半抗原上的活性基團決定，常用的方法如下:
1.2.2.1分子含有羧基或偶聯羧基的半抗原。
1)混合酸酐法:又稱氯甲酸異丁酯法。半抗原上的羧基在正丁胺的存在下與氯甲酸異丁酯反應形成混合酸酐的中間體，然後與蛋白質的氨基反應形成半抗原與蛋白質的偶聯物。
2)碳二亞胺法(CDI):碳二亞胺(EDC)使羥基和氨基脫水形成酰胺鍵，半抗原上的羧基先與EDC反應形成中間體，再與蛋白質上的氨基反應形成半抗原與蛋白質的偶聯物(見圖1.5)。EDC被稱為零長度交聯劑之壹，因為它不形成臂分子作為形成酰胺鍵的介質。
這種連接方法很簡單，只要將載體蛋白和抗原按壹定比例混合在合適的溶液中，然後加入水溶性碳二亞胺，攪拌1 ~ 2h，室溫放置24h，透析即可。如果半抗原分子不含羧基，可以通過壹些化學反應引入羧基。引入羧基後，也可以通過上述方法進行偶聯。
1.2.2.2含有氨基或可還原硝基的半抗原的偶聯
1)戊二醛法:雙功能試劑戊二醛的兩個醛基分別與半抗原和蛋白質上的氨基形成席夫鍵(-n = c
2)重氮化法:用於以芳香氨基為活性基團的半抗原，芳香氨基與NaNO2、HCl反應得到重氮鹽，重氮鹽可直接連接到蛋白質酪氨酸羧基的鄰位，形成偶氮化合物(見圖1.6)。
1.3.2.3含羥基半抗原的偶聯
1)琥珀酸酐法:半抗原的羥基與琥珀酸酐在無水吡啶中反應得到琥珀酸半酯(帶羧基的中間體)，再用碳二亞胺法或混合酸酐法與蛋白質氨基結合，在半抗原和蛋白質載體之間插入壹個琥珀酰基(圖1.7)。
2)羰基二咪唑法:N，N’-羰基二咪唑是壹種引入羰基的高活性試劑，在肽合成中首次被證明是壹種優良的酰胺鍵形成試劑[33]。含羥基的分子與羰基二咪唑反應生成中間體咪唑甲酸酯，再與N-親核試劑反應得到N-烷基化甲酸酯鍵。通常蛋白質通過N端(α-氨基)和賴氨酸側鏈(ε-氨基)與分子形成不帶電的氨基甲酸酯類衍生物，具有優異的化學穩定性。
1.2.3影響人工抗原質量的因素
人工抗原的免疫原性與許多因素有關。對於不同的物質，影響免疫原性的因素並不完全相同，往往需要在獲得抗體後重新調整免疫偶聯物的具體合成方法。但壹般來說，影響人工抗原質量的主要因素有:
1)耦合比
蛋白質分子上附著的半抗原的數量比以前認為的盡可能多。但實驗證明，半抗原過多並不能得到預期的結果，因為覆蓋在載體上的半抗原過多可能不利於載體與淋巴細胞表面的結合，載體無法引起免疫反應。事實上，每個載體分子上附著壹個半抗原分子就足以產生抗體。有人認為，以BSA為例，蛋白質分子上附著的半抗原數量應為5 ~ 20個。但榮康泰等人在用不同的載體制備對氧磷人工抗原時，發現無論分子量接近與否，各載體的最佳結合比例都不壹樣，建議逐壹確定各載體的最佳結合比例，以獲得最佳免疫效果。
2)耦合橋
有研究者認為，壹定長度臂的介入有助於將半抗原暴露在外，有利於增強所產生抗體的特異性。例如，吳等[34]發現離載體蛋白組越遠，其特征反應越明顯。然而，壹些研究人員發現，臂結構經常對免疫檢測產生不利影響。有時，產生的抗體對臂結構的親和力特別強，但對待檢測的小分子的親和力很弱，從而幹擾對特定抗體的檢測。Sionf等人[35]認為可以采用兩種方法來避免偶聯橋帶來的缺點:壹種是半抗原與蛋白質在同壹位點結合，但免疫原和包被抗原使用不同的偶聯橋；第二，免疫原和包被抗原使用相同的偶聯橋，但結合不同的半抗原位點。Friedia [36]對農藥的酶免疫分析進行了多年的研究，他認為最好的偶聯橋是3 ~ 6個線性碳原子的結構。
3)半抗原的分子空間結構
用作半抗原的分子最好有分支結構，直鏈分子很難產生抗體。此外，壹些抗生素或殺蟲劑具有多個蛋白質偶聯位點。但據研究報道，不同位點與蛋白質結合制備的人工抗原的抗體效價和親和力是不同的，這可能是由於半抗原的空間結構不同。如滅草松和吡蟲啉人工抗原合成時，半抗原不同位點與載體結合，抗體效價和親和力明顯不同[37，38]。所以，如果壹個分子中有很多不同的結合位點，最好盡可能利用不同的位點合成人工抗原，然後通過比較，選擇最佳的人工抗原，制備抗體進行檢測。
1.2.4人工抗原的質量評價
1.2.4.1濃度測定
人工抗原的絕對含量往往用蛋白質的相對濃度來表示(例如每毫升抗原溶液中含有多少毫克蛋白質)。因此，人工抗原濃度的測定與人工抗原溶液中蛋白質相對含量(mg/ml)的測定是壹致的(也反映了人工抗原越純，檢測的濃度值越準確)。常用的方法有紫外吸收法、福林酚法、縮二脲法、微量凱氏定量法、染色結合法和熒光法。這裏就不介紹了。
1.2.4.2純度鑒定和結構分析
鑒定農藥人工抗原最常用的方法是紫外光譜掃描法。如果人工抗原的紫外吸收光譜與原始載體蛋白和半抗原的紫外吸收光譜不同，可以初步證明人工抗原的合成成功。
半抗原和載體分子反應後是否真的連接，如果是，它們的連接基團在哪裏。這些問題可以通過紅外吸收譜圖或質譜分析來解決。
人工抗原的偶聯純度可以通過吸附和分配色譜以及電泳來鑒定。前者適用範圍廣，但識別靈敏度低。後者用於鑒定大分子酶標記物和壹些半抗原結合物的純度。如果電泳圖譜上只有壹條電泳帶，說明人工抗原已經達到電泳純度，否則說明人工抗原含有有利的未偶聯物質。