聚合酶鏈式反應的反應系統
在典型的PCR反應系統中，應加入適當的緩沖液、微量模板DNA、4×dNTPs、耐熱聚合酶、Mg2和兩個合成DNA引物。模板DNA在94℃變性65438±0分鐘，引物和模板在40 ~ 60℃退火65438±0分鐘，72℃延伸2分鐘。第壹次循環前，模板預變性3 ~ 5分鐘；最後壹個循環後，樣品仍需延伸3 ~ 5分鐘以上，以保證擴增的DNA為雙鏈DNA。為了便於了解PCR反應中各組分的組成、用量和反應條件，使人們針對不同的研究對象逐壹改變，找到最佳的反應條件，現將塞特斯珀金埃爾默公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應條件列出，以供參考。對於用於PCR的標準緩沖液，參見PCR操作的例子。在72℃時，反應體系的pH值將下降1個單位，接近7.2。二價陽離子的存在非常重要，它影響PCR的特異性和產量。實驗表明，Mg2優於Mn2，Ca2無影響。
1.Mg2 Mg2的最佳濃度為1.5mmol/L(當各種dNTP的濃度為200mmol/L時)，但對於任何模板和引物的組合都不是最佳的。靶序列與引物第壹次結合時，Mg2的濃度應調整到最佳，濃度變化範圍為1 ~ 10 mmol/L，Mg2過量易生成非特異性擴增產物，Mg2不足易降低產量。
樣品中較高濃度的螯合劑如EDTA或較高濃度的帶負電荷的離子基團如磷酸鹽將與Mg2結合並降低Mg2的有效濃度。因此，用作模板的DNA應溶解在10 mmol/L tris-HCl(pH 7.6)0.1 mmol/L EDTA中。
DNTP含有磷酸鹽，其濃度的變化會影響Mg2的有效濃度。標準反應體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低於Mg2的濃度1.5 mmol/L..因此，在高濃度DNA和dNTP的條件下，必須相應地調整Mg2的濃度。
2.Tris -HCl緩沖液10 ~ 50mmol/l tris-HCl緩沖液用於PCR，其他類型的緩沖液很少使用。Tris緩沖液是壹種雙極離子緩沖液，pKa為8.3 (20℃)，PKA為0.021/℃。因此，當20 mmol/L Tris的pH為8.3 (20℃)時，在典型的熱循環條件下，真實的pH值在7.8-6.8之間。
3.KCl濃度50毫摩爾/升的K濃度能促進引物退火。然而，研究表明，當NaCl濃度為50 mol/L時，當KCl濃度高於50 mol/L時，Taq酶的活性會受到抑制，而很少或沒有KCl對PCR結果的影響很小。
4.明膠明膠和BSA或非離子型去汙劑有穩定酶的作用。壹般用量為100μg/ml，但目前的研究表明，加或不加都可以獲得很好的PCR結果，作用不大。
5.二甲基亞碸(DMSO)在使用Klenow片段的PCR中是有用的；加入10% DM-SO有利於減少DNA的二級結構，使得(G C)%含量高的模板容易完全變性。反應體系中加入DMSO更容易直接測序PCR產物，但當超過10%時，會抑制Taq DNA聚合酶的活性。因此，大多數情況下不使用DMSO。在PCR反應體系中，dNTP終濃度高於50 mol/L會抑制Taq酶的活性，使用低濃度dNTP可以減少非靶位起始和延伸時核苷酸的錯誤摻入，而高濃度dNTP容易造成錯誤摻入，濃度過低則必然降低反應物的產率。PCR常用濃度為50 ~ 200μ mol/L，不能低於10 ~ 15μ mol/L..四種dNTP的濃度應該相同，其中任何壹種都會誘導聚合酶錯誤摻入，減慢合成速度，過早終止反應。
決定dNTP最低濃度的因素是靶序列DNA的長度和組成。例如，在100μl的反應體系中，如果4×dNTPs的濃度為20μmol/L，基本上可以合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L 4×dNTPs可合成6.6μgDNA，而200μmol/L足以合成25μg/DNA。
壹般從廠家購買的dNTP溶液的pH值是不調整的。用1mol/l NaOH調節dNTP儲存溶液的pH值至7.0，以保證反應的pH值不低於7.1。市場上購買的遊離核苷酸凍幹粉溶解後要用NaOH中和，然後用紫外分光光度計定量。在典型的PCR反應混合物中，酶濃度為2.5U/μl，常用的範圍為1 ~ 4U/100μ L..由於DNA模板和引物的不同，以及其他條件的不同，聚合酶的用量也不同，酶太多會導致非特異性產物的增加。
由於廠家使用的配方、生產條件、活性定義不同，不同廠家供應的TaqDNA聚合酶性能也不同。
塞特斯公司對酶的定義是:1酶單位是指在以下分析條件下，將10 mmol dNTP在74℃下30min內混合成酸不溶性組分所需的酶。測定時間為10min，換算成30min劑量。
分析條件為25nmol/L TAPS(三羥甲基氨基丙烷磺酸鈉，pH9.3.25℃)，50 μm ol/L KCl，2mmol/L MgCl2.1mmol/L β-ME(巰基乙醇)，200 mmol/L dATP，dTTP和dGTP，6540 mmol/L dCTP。單鏈和雙鏈DNA或RNA可以用作PCR樣品。如果起始材料是RNA，第壹個cDNA必須通過逆轉錄獲得。雖然PCR只能使用極少量的樣本，甚至是單個細胞的DNA，但為了保證反應的特異性，ng級克隆DNA、μg級單拷貝染色體DNA或104拷貝的待擴增片段也被用作起始材料。模板可以是粗制的，但不能與任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑和能與DNA結合的蛋白質混合。
DNA的大小不是關鍵因素，但當使用極高分子量的DNA(如基因組DNA)時，如超聲處理或用稀有限制性內切酶(如Sal1和Not1)消化，擴增效果更好。閉環靶序列DNA的擴增效率略低於線性DNA，所以在作為反應模板時最好先將質粒線性化。
模板靶序列的濃度因情況而異，這通常超出實驗者的控制。在實驗中，可以根據已知的目標序列量的逆還原(1ng，0.1ng，0.001ng等)設定壹組對照反應。)來檢驗擴增反應的靈敏度是否符合要求。瓊脂糖凝膠電泳在實際工作中經常使用。壹般在電泳緩沖液或凝膠中加入1%溴化乙錠(EB)(每100ml加入100μl)，然後將配制好的1% ~ 2%瓊脂糖凝膠(用電泳緩沖液配制)放入電泳槽中，向待測樣品中加入65438+。瓊脂糖的濃度要根據分離出的DNA片段大小來選擇，壹般為1.5% ~ 2%，電泳電壓為75V。當樣品距離凝膠端65438±0cm以內時，切斷電源，取出凝膠，在紫外燈下直接觀察結果。
由於溴化乙錠能與雙鏈DNA形成偶聯物，在紫外燈下能發出熒光，使EB的熒光強度增強80 ~ 100倍，因此電泳後的凝膠在紫外燈下可直接觀察到。壹般肉眼觀察到的DNA量可達10ng，其熒光強度與DNA含量成正比。
DNA分子在凝膠中的遊動速度是由電荷效應和分子效應決定的。前者由凈電荷決定，後者與分子大小和構型有關。根據DNA分子的大小，可以不同地調節其凝膠濃度。有條件的實驗室也可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對擴增的DNA片段進行分析。PCR技術必須有合理的合成引物和提取的樣品DNA，然後進行自動熱循環，最後進行產物鑒定和分析。目前，引物的設計和合成只能在少數技術力量較強的研究所和研究所進行，臨床應用只能通過購買PCR檢測試劑盒進行。PCR自動熱循環的影響因素很多，對於不同的DNA樣品，PCR反應中各種成分的加入量和溫度循環參數不壹致。幾個主要影響因素介紹如下。
第壹，溫度循環參數
在PCR的自動熱循環中，最關鍵的因素是變性和退火溫度。如操作實例所示，變性、退火和延伸的條件為:94℃60s，37℃60s，72℃120s，* * * 25 ~ 30個循環，擴增片段為500bp。這裏，每壹步的時間應該在反應混合物達到所需溫度後計算。在自動熱循環儀中，將混合溶液的原始溫度改變到所需溫度需要30 ~ 60s。該滯後時間的長度取決於幾個因素，包括反應管的類型、壁厚、混合溶液的體積、熱源(水浴或加熱塊)和兩個步驟之間的溫差。在設置熱循環時應充分重視和考慮，並對每個儀器進行測量。
關於熱循環時間的另壹個重要考慮是兩個引物之間的距離；距離越長，合成全長靶序列所需的時間就越長。上面給出的反應時間是根據最合適的合成長度為500bp的靶序列擬定的。下面介紹各種溫度的選擇。
1.模板變性溫度變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA解鏈的溫度。如果沒有達到變性溫度，將不會產生單鏈DNA模板，也不會啟動PCR。如果變性溫度低，變性會不完全，DNA雙鏈會很快復性，從而降低產量。壹般取90 ~ 95℃。壹旦樣品達到這個溫度，就應該迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒鐘，不需要太長時間；相反，應盡可能縮短高溫下的時間，以保持Taq DNA聚合酶的活性，加入Taq DNA聚合酶後的最高變性溫度不應超過95℃。
2.引物退火溫度退火溫度決定PCR特異性和產量；高溫特異性強，但如果過高，引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降；低溫導致高產量，但過低的溫度會造成引物和模板的錯配，增加非特異性產物。通常，從37℃的反應條件開始，設置壹系列控制反應來確定特定反應的最佳退火溫度。也可以從引物的(G C)%含量來推斷，把握測試的起點。壹般情況下，退火溫度比擴增引物的解鏈溫度TTm低5℃,可根據公式計算:
Ta = Tm -5℃= 4(G C) 2(A T)-5℃
其中a、t、g和c分別代表相應堿基的數量。例如，對於20個堿基的引物，如果(G . C)%的含量為50%，則Ta的起點可以設定為55℃。在典型的引物濃度下(如0.2μmol/L)，退火反應可在幾秒鐘內完成，無需長時間退火。
3.引物延伸溫度的選擇取決於Taq DNA聚合酶的最適溫度。壹般溫度在70 ~ 75℃。在72℃時，酶催化核苷酸的標準速率可達35 ~ 100核苷酸/秒。每分鐘可以延伸1kb的長度，其速度取決於緩沖液的組成、pH值、鹽濃度和DNA模板的性質。如果擴增片段短於150bp，可以省略延伸步驟，變成雙溫循環，因為Taq DNA聚合酶可以在退火溫度下完成短序列的合成。對於100 ~ 300 BP之間的短序列片段，采用快速簡單的雙溫循環是有效的。此時，引物延伸溫度與退火溫度相同。對於1kb以上的DNA片段，可根據片段長度將延伸時間控制在1 ~ 7min。同時要在PCR緩沖液中加入明膠或BSA試劑，使Taq DNA聚合酶長期保持活性和穩定性。1.5% ~ 20%甘油有助於擴增約2.5kb或更長的DNA片段。
4.常規PCR的循環數壹般為25 ~ 40個循環。常見的錯誤是循環太多，背景非特異性嚴重，復雜性增加。當然，如果循環反應次數太少，收率也會低。所以在保證產品良率的前提下，盡量減少循環次數。
擴增後，將樣品冷卻並保存在4℃下。
二、引物引物設計
為了擴增模板DNA，應該首先設計兩個寡核苷酸引物。所謂引物，其實就是與待擴增的靶DNA序列互補的兩個寡核苷酸片段。兩條引物之間的距離決定了擴增片段的長度，兩條引物的5’末端決定了擴增產物的兩個5’末端位置。可見，引物是決定PCR擴增片段長度、位置和結果的關鍵，引物設計更為重要。
引物設計的必要條件是與引物互補的靶DNA序列必須是已知的，兩個引物之間的序列可能不明確。這兩個已知序列壹般為15 ~ 20個堿基，可以用DNA合成儀合成與之對應的兩條引物。此外，引物設計中通常遵循的原則包括:
1.引物長度根據統計計算，壹個長度約為17個堿基的寡核苷酸序列在人類基因組中出現的概率為1次。因此，引物的長度壹般不小於16個核苷酸，但不超過30個核苷酸，最佳長度為20 ~ 24個核苷酸。這種短寡核苷酸在聚合溫度(72℃)下不會形成穩定的雜交體。有時可以在5’端加入與模板不互補的序列，如限制性位點或啟動子，完成基因克隆等特殊需要；引物5’末端的生物素標記或熒光標記可用於各種目的，如微生物檢測。有時候底漆不工作原因不明，可以通過移動位置來解決。
2.(g c)%含量的底漆成分要均勻，盡量避免含有相同的基礎聚合物。兩條引物中(G C)%的含量應盡可能相近，擴增片段中(G C)%的含量已知時，應與待擴增片段接近，壹般40% ~ 60%為好。
3.應避免在引物中形成明顯的二級結構，尤其是發夾結構。例如:
4.兩個引物之間應該沒有互補性，尤其是在引物的3’末端。即使不可避免，3’端的互補堿基也不能超過2個堿基，否則容易產生“引物二聚體”或“引物二聚體”。引物二聚體本質上是在DNA聚合酶的作用下，壹個引物在另壹個引物序列上延伸形成的長度與兩個引物相近的雙鏈DNA片段，是PCR的常見副產物，有時甚至是主要產物。
另外，兩個引物之間沒有同源序列，尤其是六個以上的寡核苷酸片段具有相同的堿基，否則兩個引物會相互競爭模板的相同位點；類似地，待擴增的靶DNA或樣品DNA的引物和其它序列不能具有超過6個堿基的同源序列。否則，引物會與其他位點結合，降低特異性擴增，增加非特異性擴增。
5.在引物的3’端配對DNA聚合酶是在引物的3’端增加壹個單核苷酸，因此引物3’端5 ~ 6個堿基與靶DNA的匹配要求必須準確嚴格，才能保證PCR的有效擴增。
引物設計是否合理，可以用PCRDESN軟件和美國PRIMER軟件進行計算機檢索驗證。
合成的寡核苷酸優選通過色譜法或PAGE純化，以除去雜質，如未合成全長的短鏈。純化後的引物保存在4℃的25%乙腈溶液中，能抑制微生物的生長。壹般情況下，未使用的底漆應保存在-20℃的冰箱中，底漆在液體中可保存6個月，凍幹後可保存1 ~ 2年。
第三，DNA聚合酶
1956年，科恩伯格等人從大腸桿菌的提取液中發現了DNA聚合酶，並獲得了DNA聚合酶I的純品，DNA聚合酶I由分子量為109000的多肽鏈組成，可被枯草桿菌蛋白酶分解成兩個片段。壹個片段具有聚合酶活性，分子量為76000，核酸外切酶活性為3’→5，即Klenow片段。另壹個片段的分子量為34，000，具有5’→‘3’核酸外切酶活性。所以DNA聚合酶有幾個作用:壹個是聚合作用，以DNA為模板，將dNTP中的脫氧核苷酸壹個壹個加到3-OH末端。二是具有‘3’→5’核酸外切酶活性，能識別和消除錯配的引物末端，與復制時的校正功能有關。第三種是5’→3’核酸外切酶活性，可以從5’端水解核苷酸，通過幾個核苷酸的作用去除錯配的核苷酸。1985年，穆利斯等人發明了PCR法。在用Klenow片段完成β-珠蛋白的PCR後，國際上許多實驗室考慮用耐熱DNA聚合酶代替Klenow片段進行PCR，使得耐熱聚合酶的研究迅速發展。耐熱DNA聚合酶已從許多生活在60℃(嗜熱脂肪芽孢桿菌)至87℃(溶劑化鏈球菌)的細菌中分離和純化，但壹些酶不能耐受DNA變性所需的溫度，因此不能用於PCR。
1.Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大腸桿菌DNA聚合酶ⅰ的Klenow片段是使PCR得到廣泛應用的關鍵。Klenow片段不能耐受雙鏈DNA 95℃的變性溫度，所以每個循環都要加入新的酶；Taq DNA聚合酶可耐受93 ~ 95℃的高溫，避免了加入聚合酶的繁瑣操作，同時提高了退火和延伸溫度，減少了非特異性產物和DNA二級結構對PCR的幹擾，提高了PCR的特異性、產量和靈敏度。兩者相比，主要區別有:①①kle now酶的最適溫度為37℃，擴增產物不全是目的序列，需要用探針檢測。Taq酶不僅產量高，而且特異性強。其最適溫度為74 ~ 75℃。因此，可以提高退火溫度，提高退火嚴格性，減少錯配引物的延伸。②周期後期，酶量逐漸不足，導致斜率平緩。對於Klenow酶(都以1μg基因組DNA開始)和Taq酶，到達平波的循環數分別為20和30。Taq酶的延伸片段長度小於10kb，Klenow酶的延伸片段長度小於400bp。
Taq酶分離自嗜熱細菌YT 1。該菌株由Brock於1969從美國黃石國家公園的溫泉中分離得到。作為棲熱菌的標準菌株，其生長溫度為70 ~ 75℃。從中分離出分子量為60 ~ 68 kDa，比活為2000 ~ 8000 U/mg的DNA聚合酶。後來，塞特斯公司的Kary Mullis分離出比活力為200，000 U/mg，分子量為93，965，438+00的純酶。這種9.4KDa酶的最適溫度為75 ~ 80℃，與簡單核苷酸的結合率(Kcat)可達150核苷酸(nt)/s酶分子。以M13為模板，用富含G . c .的30bp引物延伸，70℃，KACT >:60nt/s；55℃時24nt/s；37℃時為65438±0.5 nt/s，22℃時低至0.25nt/s。當溫度高於90℃時，DNA合成活性很差。在這種高溫條件下，引物和模板不能牢固結合。
在PCR反應混合液中，Taq酶在92.5℃、95℃和97.5℃保持50%活性的時間分別為65438±030、40和5 ~ 6 min，50個PCR循環中管內最高溫度為95℃。時尚可以保持65%的活力，每周期20s。Taq酶在95℃的半衰期為40分鐘，因此在PCR循環中選擇的變性溫度不應高於95℃。
Taq酶可通過基因重組產生，其商品名為Ampli Taq(塞特斯公司)。Taq酶的完整基因長2499bp，在大腸桿菌中表達和生產，含有832個氨基酸。氨基酸序列與大腸桿菌DNA聚合酶ⅰ有38%的同壹性，包括與dNTP的結合。Taq酶中存在引物和模板作用區。
Taq酶有壹個依賴於DNA合成的5’→‘3’核酸外切酶活性，所以模板上有壹個退火的3’-磷酸化的“阻斷劑”，它會被壹個壹個地切斷，而不阻止從上遊引物鏈的延伸。但是，對於用5’-32P標記的合成寡核苷酸引物，無論是單鏈還是用模板復性都沒有發現降解，因此這種活性不會影響PCR結果。Taq酶沒有3’→‘5’核酸外切酶活性，如果dNTP被錯誤摻入，這種酶沒有糾正能力。所以用Taq酶進行PCR時，產物有很多中點突變，不利於克隆。壹般摻雜比為1.25×10-4 ~ 1×10-5(4×DNTPS濃度為200μmol/L，Mg2為1.5mmol/L，55℃退火)。但缺少3’→5’核酸外切酶活性有利於測序。
2.影響酶活性的因素Taq酶的活性受Mg2+的影響。以鯡魚精DNA為模板，總dNTP濃度為0.7 ~ 0.8 mmol/L，Mg2濃度為2.0mmol/L時，激活能力最高。當濃度超過這個值時，就會產生抑制作用。10mmol/l氯化鎂的抑制活性達40% ~ 50%。DNTP能與Mg2結合，所以遊離Mg2只是結合後的剩余量。當總dNTP濃度高達4 ~ 6 mmol/L時，Taq酶活性會下降20 ~ 30%，即底物抑制。
當dNTP濃度較低時，PCR的產率和特異性增加，適用於擴增摻入法標記生物素和放射性元素。當100μl PCR溶液中含有40μmol/L dNTP時，足以合成2.6μg DNA(dNTP消耗壹半)。
以70℃10分鐘鯡魚精DNA中dNTP的摻入量計算，標準條件為100%。
純的9.4KDa Taq酶不含3’→5’核酸的核酸外切酶活性。錯誤分類率取決於dNTP的濃度。但Taq酶具有5’→3’核酸的DNA依賴性核酸外切酶活性。對5′→3′32p標記的寡核苷酸單鏈或與MB模板雜交幾乎沒有降解能力。
中等濃度的KCl可使Taq酶合成活性提高50% ~ 60%，KCl的最適濃度為50 mol/L，較高濃度則有抑制作用。>;200mmol/L KCl可使酶失活。
加入50mmol/L NH4Cl或NH4Ac或NaCl可產生中度抑制或無影響。
低濃度的尿素、DMSO、DMF或甲酰胺影響不大，吐溫20/NP40能消除SDS(0.01%和0.1%)的抑制作用。
3.第二代耐熱DNA聚合酶的stoffel片段:塞特斯公司的Stoffel去掉了TaqDNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性片段(N端289個氨基酸)，稱為Stoffel片段。Taq DNA聚合酶在97.5℃的半衰期從5 ~ 6 min提高到20min，酶片段也更有利於兩個或多個模板位點的擴增反應，即多重PCR。
VentTMDNA聚合酶:由美國新英格蘭生物實驗室公司從能在98℃生長的超嗜熱細菌Thermococcus litoralis中分離純化，故命名為Vent酶。它的壹些酶學性質優於Taq DNA聚合酶。能耐受100℃高溫並保持活性2小時以上，具有糾正3’→5’核酸外切酶活性的能力，假擴增概率比Taq DNA聚合酶低壹倍。後來公司將深噴口DNA聚合酶基因移植到從壹艘深水潛艇(2010m)噴口分離出的GB-D菌株中，該菌株能在104℃生長，深噴口DNA聚合酶在95℃的半衰期達到23h(噴口酶6.7h，Taq酶1h)。
4.rTth逆轉錄酶目前RT-PCR發展很快，因此對耐熱RNA依賴的DNA聚合酶的研究也取得了進展。壹些實驗表明Taq DNA聚合酶具有RNA依賴的DNA聚合酶活性，但活性較弱。在1991中，塞特斯公司推出了壹種RTTH反轉錄物，具有良好的依賴RNA和依賴DNA的耐熱DNA聚合酶活性，兩種活性分別依賴Mn2M2，使酶活性可以分開控制。使用這種酶，只需要250ng的總RNA就可以有效地進行RT-PCR，並且可以獲得特異性的DNA片段，這對逆轉錄PCR的發展非常有利。
耐熱DNA聚合酶的研究取得了很大進展，對PCR的發展起到了重要作用。相信隨著進壹步的研究，人們對耐熱DNA聚合酶的認識和應用將會進壹步發展。
PCR在中國的研究發展迅速，其關鍵試劑——耐熱DNA聚合酶已在復旦大學遺傳研究所、華美公司、中國醫學科學院基礎醫學研究所等多個實驗室分離純化。後兩種菌株為嗜熱棲熱菌yt-1。前者是從我們篩選的嗜熱菌中分離純化的。復旦大學遺傳研究所也成功克隆了這種聚合酶的基因，獲得了壹種耐熱的F4DNA聚合酶，其酶學性質與Taq DNA聚合酶非常接近，為中國PCR的發展提供了保障。
第四，影響PCR特異性的因素
通過以上內容。可以看出，影響PCR特異性的因素有很多，我們在這裏總結壹下，供大家參考:①退火步驟的剛性:提高退火溫度可以減少錯配雜交，從而提高特異性。②縮短退火時間和延伸時間可以減少錯誤引發和錯誤延伸。③引物二聚化是最常見的副產物，降低引物和酶的濃度也可以減少假啟動，尤其是引物二聚化。④改變氯化鎂濃度(有時是KCl)可以提高特異性，這可能是對Taq酶的直接作用。⑤如果模板中存在二級結構，例如當待擴增的片段容易形成發夾結構時，可以在PCR混合物中的4×dNTPs上添加7-脫氮-2’-脫氧鳥苷-5’-三磷酸(De7GTP)。如果de7GTP和dGTP的混合物是3:1(150 μm ol/l de 7 GTP 50 μm ol/l DGTP)而不是200μmol/l dGTP，則可以防止非特異性產物的形成。
動詞 （verb的縮寫）擴大平坡
放大反應不可能無限進行下去。經過壹定的循環後，待擴增的片段不再呈指數增長而是逐漸進入平緩的斜坡。進入平坦斜坡的循環次數取決於開始時的模板拷貝數和合成的DNA總量。所謂平坡，就是批量PCR循環的後期。當合成產物達到0.3 ~ 1 pmol時，由於產物的積累，原來的指數增長速率變成了平坦的曲線。PCR進入平坡的原因是:引物和dNTP的消耗，Taq酶的失活，這些在標準反應中不會出現。此外，還有幾種可能性:
1.底物過剩是由於反應溶液中DNA合成的量多於Taq酶。當反應液在100μl中含有2.5Utaq酶時，DNA合成量達到1μg(3nmol脫氧核苷酸)時，開始變成底物過剩。延長延伸時間或添加Taq酶可以克服。但並不實用，因為每進行壹次下壹個周期，延長時間會增加壹倍，並加入Taq酶保持指數增長。
2.非特異性擴增產物的競爭與上述情況密切相關。這時，不需要的DNA片段和需要的片段同時競爭聚合酶。為了克服這種情況，需要提高反應特異性，使不必要的片段不能大量積累。
3.退火時，產品的單鏈會自我結合。退火時，兩個單鏈DNA片段也可以與引物發生關聯，這也會阻止產物增加。當產品濃度達到10pmol/100μl時會出現這種現象，除稀釋外無法克服。
4.產物高濃度條件下變性，產物不完全熔化，最終產物受阻(焦磷酸化，雙鏈DNA)。
總之，PCR的條件因系統而異，沒有統壹的最優條件。首先選擇壹般的條件擴增，然後稍微改變參數，就可以達到最優化，獲得優異的特異性和產量。