膠水回收套件(歐米茄)操作步驟
我們強烈建議使用新鮮的TAE/TBE電泳緩沖液。不要重復使用電泳緩沖液,舊的電泳緩沖液PH值會升高,降低DNA的回收產量;
2.電泳足夠時間後,在紫外燈下小心切下需要的DNA片段。試著去除多余的凝膠。
註意:DNA在紫外燈下的暴露時間不能超過30秒,在紫外燈下操作時必須戴防護眼鏡。
3.稱取空離心管,切下帶有目的片段的凝膠,放入1.5ml離心管中,稱取重量,計算凝膠塊的重量,近似確定其體積。壹般來說,凝膠的密度為1g/ml,所以凝膠的體積與重量的關系可以換算為:凝膠片的重量為0.2g,其體積為0.2ml;加入7倍凝膠體積的結合緩沖液,置於55℃~65℃的水浴中7分鐘,直至凝膠完全融化,每2 ~ 3分鐘攪拌均勻壹次;
重要提醒:註意凝膠完全溶解後凝膠結合緩沖液混合物的pH值。如果pH值大於8,DNA的產量會大大減少。觀察混合物的顏色。如果是橙色或紅色,加入5μl濃度為5 M、pH值為5.2的醋酸鈉,降低其pH值。調整後,混合物的顏色將恢復正常的淺黃色。壹般來說,當使用新鮮的電泳緩沖液時,凝膠結合緩沖液混合物的PH值不會增加。
4.將700μl DNA-瓊脂糖溶液轉移到HiBindTM DNA柱上,將柱置於幹凈的2ml收集管中,室溫下離心10,000×g 1分鐘,棄去液體。
HiBind DNA柱最多可容納700μl溶液。如果DNA-瓊脂糖混合物的體積大於700μl,可以先將700μl的溶液轉移到柱中,離心後可以將剩余的溶液加入到柱中。但每根HiBindTM柱最多能結合25~30μg DNA。如果預期輸出很大,請將樣本添加到適當數量的列中。
5.將柱放回收集管中,並向HiBind DNA柱中加入300μl結合緩沖液;室溫下10000×g離心1分鐘,棄去濾液;這壹步相當關鍵,不要忽視。
6.將柱放回收集管中,向HiBind DNA柱中加入700μl SPW洗滌緩沖液,室溫離心10,000×g 1分鐘,棄去濾液;註意:SPW洗滌緩沖液在使用前必須根據瓶標識的要求用無水乙醇稀釋。
7.將柱放回收集管中,反復向HiBind DNA柱中加入700μl SPW洗滌緩沖液,室溫離心10000×g 1分鐘,棄去濾液;
8.棄去液體,將空柱放回收集管中,在10,000×g離心1分鐘,甩去柱基質中的殘留液體。
這壹步可以去除柱基質上殘留的乙醇,所以不要省略這壹步——獲得良好的DNA產率非常重要。
9.將柱置於幹凈的1.5ml離心管中,加入30~50μl洗脫液或對水柱上的膜進行滅菌,10000×g離心1分鐘,離心管中的溶液即為純化的DNA產物,保存於-20度。
如果再洗脫,可以洗脫殘留的DNA,但濃度會更低。
DNA的產量和質量:
純化產物的樣品稀釋壹定倍數後,分別在260nm和280nm處測量光吸收值。回收DNA的濃度可根據以下公式計算:DNA濃度=吸光值260×50×稀釋倍數μg/ml。
長度超過500bp的片段通常可以純化,產率為80%。50bp~500bp的回收率可達55%~80%。(光吸收260/光吸收280)的比值是核酸純度的標誌。如果該值為1.8,則表示核酸的純度>:90%。另壹方面,如果純化產物的產量低,可以通過瓊脂糖EB電泳來估計產物的濃度。