我下壹篇博士論文，題目是“蜂膠制品加工工藝研究及其生物功能評價”，請大家幫忙。非常感謝！！
蜂膠產品加工工藝及其生物功能評價研究
曹偉
蜂膠是蜂蜜采自外膠植物(如柏樹、樺樹、楊樹、柳樹、松樹、漆樹、橡樹等)的嫩芽或樹皮傷口處，混以蜜蜂下頜腺和蜂蠟而成的壹種紅棕色、黃褐色、褐色或藍綠色粘稠固體。蜂膠是蜂巢的主要產品之壹。蜜蜂收集蜂膠並將其塗抹在蜂巢周圍。其目的是保護蜂巢的蜂產品，如蜂蜜、花粉、蜂王漿等不變質，也是為了保護蜂巢的環境。人類認識蜂膠已經有幾千年了，尤其是在國外。早在3000年前，古埃及人就知道蜂膠，並將其作為木乃伊的防腐材料。在古希臘，亞裏士多德(公元前384-322年)在觀察蜜蜂時也發現了蜂膠。他在其代表作《動物群》第九卷第14章中記載了蜂膠的起源，並指出這種帶有刺激性氣味的“黑蠟”可用於治療皮膚病、刀傷和化膿。古羅馬百科全書《自然史》的作者普林尼(公元23 ~ 79年)指出，蜂膠是蜜蜂采集的柳樹、楊樹、栗子等植物的新芽分泌的樹脂，有記載蜂膠能止神經痛、肌肉硬結、清除已滲入體內的異物。
近年來，蜂膠有效成分和生物學功能的研究取得了很大進展。已從蜂膠中分離鑒定出數百種化合物，其中黃酮類、二氫黃酮類、壹些有機酸及其衍生物是蜂膠的主要活性成分。在對蜂膠生物學功能的研究中，發現蜂膠具有以下生物學功能:①抗病原微生物；(2)提高機體免疫力；③抗癌作用；④治療高脂血癥的效果；⑤局部麻醉；⑥促進組織再生；⑦抗氧化作用。蜂膠的上述生物功能使其廣泛應用於外科、皮膚病、耳鼻喉、口腔科、內科等疾病，並取得了良好的治療效果。
我國對蜂膠的認識和利用較晚，這與東方蜜蜂不具備采集和加工蜂膠的能力有關。西方蜜蜂在20世紀初傳入中國，直到70年代才有少數研究者在中國對蜂膠進行初步研究，90年代有了很大進展。我國對蜂膠的開發利用遠遠落後於國外，主要表現在以下幾個方面:①缺乏對蜂膠生物學功能，尤其是藥理作用的研究，對蜂膠的認識僅停留在經驗上，臨床應用也是依靠經驗來治療各種疾病，缺乏科學依據。②缺乏對蜂膠深加工技術的深入研究。蜂膠在西方國家已經開發成幾十種產品，基本實現了產業化。在中國，只有壹些小工廠生產和加工蜂膠產品，這些產品因質量差而無法打開市場。在價格上，更是難以與國外同類產品競爭。(3)由於我國尚未出臺蜂膠及其制品的質量國家標準，仍執行原商務部的行業標準，因此無法保證蜂膠原料和蜂膠制品的質量。④對蜂膠的生物學功能和應用宣傳不夠。在中國，除了少數專業人士，大多數普通消費者都不知道蜂膠是什麽。有什麽作用？由於以上原因，我國的蜂膠資源基本沒有得到開發。
衰老是生命過程中的正常現象，是體內各種生化反應的綜合過程。導致生物體衰老的因素很多，其中自由基和生物膜損傷最為顯著。根據自由基生物學的研究，人之所以衰老，原因之壹是機體在進行壹系列氧代謝的同時不斷產生自由基。過量的自由基可引起生物膜脂質過氧化，導致膜結構破壞和功能失活，細胞活力下降，機體衰老。維持體內適當水平的抗氧化劑和自由基清除劑，可以延緩生命和衰老，同時對自由基引起的其他疾病的防治也有重要作用。蜂膠富含黃酮類、酚羥基化合物和有機酸。這些物質在體外具有較強的抗氧化作用，可能是蜂膠治療多種疾病的物質基礎和機制。但目前人們對蜂膠的抗氧化機理以及在體內是否具有抗氧化作用仍知之甚少。本實驗在蜂膠加工工藝和產品開發研究的基礎上，對蜂膠的體內外抗氧化作用和改善機體運動功能的作用進行了深入研究，得出以下結論:
1.國產蜂膠及其活性成分幾乎不溶於水，所以用有機溶劑提取蜂膠及其活性成分是我國目前科研生產中常用的方法。本實驗用四種有機溶劑提取蜂膠。從實驗結果來看，蜂膠的提取率差異不顯著(P > 0.05)，黃酮類化合物的溶出率差異不顯著。甲醇、乙醇和乙酸乙酯對蜂膠的溶解率分別為60.4±2.41%、62.2±2.54%和665438+。三種方法的黃酮溶出量分別為2.81.21g/10g粗蜂膠，2.97+0.10g/10g粗蜂膠和2.75±0.16g/10g粗蜂膠。但其中蜂蠟的溶出量存在明顯差異，每10g粗蜂膠中蜂蠟的溶出量分別為0.85g、1.03g和1.64g，說明蜂蠟的溶出量隨著溶劑極性的降低而增加。雖然氯仿提取率高，但是蜂蠟的溶出量幾乎占到蜂膠的壹半。在生產中不宜作為提取蜂膠的溶劑。雖然乙酸乙酯對蜂膠的萃取率與甲醇、乙醇沒有顯著差異，但蜂膠中的無效成分太多，導致萃取物中雜質含量過高。因此，在生產中用乙酸乙酯作為溶劑提取蜂膠中的有效成分還需要進壹步研究。
甲醇和乙醇都可以用來提取蜂膠。用甲醇作溶劑提取蜂膠時，無效成分溶出較少，但甲醇毒性大，只能作為溶劑提取粗蜂膠中的有效成分，不能用於制劑。用乙醇作溶劑提取蜂膠是目前常用的方法。本實驗詳細研究了以乙醇為溶劑提取蜂膠的工藝條件。結果表明:①乙醇濃度對蜂膠有效成分的提取率影響最大，75%和95%乙醇濃度對蜂膠的提取率影響不顯著(P > 0.05)，黃酮類化合物的溶出率也無差異。當乙醇濃度低於65%時，蜂膠中的活性成分。雖然溶劑溫度對蜂膠的提取率影響很大，但是蜂蠟的溶解也急劇上升。當提取溫度從25℃升高到45℃時，提取物呈凝膠狀，不能用於生產。料液比壹般在1∶10以上時，蜂膠及其有效成分的溶出量無顯著差異。每次提取時間應超過32小時。
目前，在許多研究中，只有蜂膠的乙醇提取物作為衡量先進提取技術的指標。本實驗結果表明，蜂膠中有效成分黃酮類化合物和無效成分蜂蠟的溶出量也應作為蜂膠產品的壹項重要質量指標。
2.增加蜂膠中有效成分在水中的溶出度，可以充分發揮其生物功能，同時對拓展蜂膠的應用領域具有重要意義。實驗發現，吐溫系列增溶劑對蜂膠的增溶能力不同。吐溫-20最大，10g吐溫-20能將3.27g蜂膠完全溶解在水中，而吐溫-80、吐溫-40和吐溫-60依次下降，分別達到3.02g、2.87g和2.63g。當分析吐溫系列增溶劑的HLB值及其對蜂膠的增溶能力時，發現隨著吐溫系列增溶劑的HLB值的增加，其對蜂膠的增溶能力也呈增加趨勢。吐溫系列增溶劑的增溶機理是增溶物質與聚氧乙烯絡合，增溶物質溶解在膠束的網格層中。吐溫-20對蜂膠中成分的絡合能力最強，能攜帶更多的蜂膠溶解在網格結構中。而吐溫-60的親水性不如吐溫-20，當其攜帶蜂膠時，其HLB下降速度比吐溫-20快，因此吐溫-20對蜂膠的增溶能力最大。Span系列非離子表面活性劑不具備蜂膠的增溶能力。
在蜂膠乳化工藝的研究中，發現蔗糖酯、黃原膠和明膠對蜂膠都有很好的乳化能力，形成的乳狀液非常穩定。分子蒸餾單酯對蜂膠沒有乳化能力，這可能與分子蒸餾單酯的HLB值低有關。明膠對蜂膠有很強的乳化能力。可能的機理是明膠本身是壹種帶有很多親水基團的蛋白質，峰膠中含有大量的酚羥基化合物，可以形成復合物。以明膠為乳化劑制備的蜂膠乳液在40℃、25℃和50℃下仍然穩定，因此明膠是制備蜂膠乳液的最佳乳化劑。
3.本試驗將酶處理技術應用於紅棗汁的制作，並對影響酶處理紅棗汁制作的主要因素進行了研究。在影響紅棗酶法制汁的因素中，酶解溫度對出汁率的影響最大。在壹定範圍內提高酶處理溫度，既能提高酶的活性，又有利於可溶性物質的溶解。但酶處理溫度也要根據所用酶的最佳作用溫度範圍來確定，否則溫度過高酶會很快失活。本實驗確定的酶處理溫度為50℃，酶解2h出汁率可達86%以上。料液比是影響紅棗酶解出汁的另壹個主要因素。實驗結果表明，在其他條件相同的情況下，料液比為1∶8時，出汁率較高。
4.紅棗是壹種高糖水果，平均含糖量為73%，特別是其中的果糖和部分低聚糖具有很強的吸濕性，直接用噴霧幹燥法制備紅棗幹粉有壹定的難度。因此，在紅棗加工過程中添加幹燥助劑是很有必要的。從實驗結果來看，麥芽糊精寡糖是生產蜂膠棗香精的良好幹燥助劑。當麥芽糊精的添加量為棗汁固形物重量的75%時，可獲得較高的出粉率(65%)，並降低了粘壁程度。當麥芽糊精的用量為100%時，可獲得95%以上的產品，且產品基本不粘壁。還發現環糊精和可溶性澱粉不適合作為蜂膠棗香精的幹燥助劑。
進料溫度對粉末噴塗效果有很大影響。當進料溫度升高時，物料進入噴霧室並迅速汽化幹燥，顆粒從塔頂沈降到塔底時基本幹燥。如果進料口溫度過低，物料幹燥不夠，粘壁現象嚴重，因此，生產蜂膠棗精時進料溫度為60℃左右。
棗汁的濃度對噴粉效果也有很大影響。當棗汁可溶性固形物含量為20% ~ 25%時，可獲得較好的噴霧效果。如果棗汁濃度太低，每個霧化顆粒中的固形物含量低，幹燥後的顆粒太小，表面積和吸濕性增加。當棗汁可溶性固形物含量高於30%，再添加30%麥芽糊精時，所得料液粘度過高，霧化顆粒固形物含量增加，顆粒表面水分蒸發快，內部水分不能及時蒸發，易形成外部幹顆粒，易吸潮，粘壁程度增加，幹燥效果變差。
5.本實驗結果表明，蜂膠乙醇提取物對黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶產生的超氧陰離子自由基和Fenton反應產生的羥自由基有顯著的抑制作用。隨著蜂膠含量的增加，清除率也明顯增加，呈量效關系。
蜂膠中含有豐富的黃酮類化合物和有機酸，這些化合物中含有相當數量的酚羥基。從本次實驗結果來看，蜂膠對兩種氧自由基的清除能力與蘆丁和槲皮素基本相同，在低劑量範圍內對氧自由基的清除作用高於槲皮素，說明蜂膠中可能存在某些化合物，對自由基的清除作用強於槲皮素，也可能是多種化合物協同作用的結果。
6.本實驗中，蛋黃蛋白中的卵磷脂受到Fe2+的攻擊，發生了明顯的脂質過氧化反應。蜂膠加入體系後，脂質過氧化作用顯著降低。結果表明，蜂膠能抑制Fe2+誘導的蛋黃脂蛋白不飽和脂肪酸脂質過氧化。與同濃度的已知脂質過氧化抑制劑蘆丁和槲皮素相比，蜂膠的抑制作用明顯強於兩者。Fe2+誘導的脂質過氧化也是氧自由基攻擊不飽和脂肪酸雙鍵的結果。蜂膠對脂質過氧化的抑制作用可能是由於通過清除氧自由基來抑制脂質過氧化。Fe2+誘導蛋黃脂蛋白多不飽和脂肪酸的脂質過氧化，然後將蜂膠加入反應體系中。結果表明，蜂膠對脂質過氧化仍有抑制作用。自由基攻擊多不飽和脂肪酸產生鏈式反應，可以產生大量的脂質自由基和氧自由基，導致鏈式反應的循環。添加蜂膠時，蜂膠中的酚羥基化合物可提供質子氫，通過去除啟動脂質過氧化的引發劑，與金屬離子結合，去除脂質自由基、脂質氧自由基、脂質過氧化物自由基等中間體自由基，阻斷脂質過氧化的反應鏈。
7.用超氧陰離子自由基和羥自由基分別攻擊肝微粒體後，脂質過氧化產物丙二醛的含量明顯高於對照組，尤其是羥自由基，對肝微粒體的氧化損傷大於超氧陰離子自由基。蜂膠棗提取物能抑制氧自由基引起的小鼠肝微粒體氧化損傷。給小鼠餵四氧嘧啶後，體內產生大量自由基，打破了正常體內的自由基平衡，刺激肝臟SOD和GSH-Px活性代償性升高。因此，模型對照組肝臟中的酶活性遠高於對照組，肝臟中的上述兩種抗氧化活性在食用蜂膠後明顯低於模型對照組，說明蜂膠能有效清除四氧嘧啶在體內誘發的自由基。
從實驗中發現，小鼠腹腔註射四氧嘧啶後，肝細胞生物膜出現強烈的脂質過氧化反應，模型對照組LPO含量明顯高於正常對照組。食用蜂膠後，肝臟中LPO含量明顯低於模型對照組，但略高於正常對照組，說明蜂膠大棗提取物對體內化學物質引起的小鼠肝損傷具有保護作用，這與蜂膠對氧自由基較強的清除能力是分不開的。
8.小鼠腹腔註射四氧嘧啶後，體內產生大量自由基，對紅細胞造成損傷。在正常生理條件下，體內的SOD和GSH-Px可以清除機體產生的多余自由基，維持體內自由基水平的平衡，四氧嘧啶產生的自由基刺激血液中抗氧化酶SOD和GSH-Px的代償性增加。模型對照組抗氧化酶活性遠高於正常對照組，蜂膠對照組和蜂膠大棗提取物組抗氧化酶活性明顯低於模型對照組，略高於正常對照組，表明蜂膠對血液氧化損傷有保護作用。通過分析血液中的LPO含量可以看出，四氧嘧啶產生的自由基可以破壞各種血細胞的生物膜，使膜發生脂質過氧化。模型對照組的LPO含量明顯高於正常對照組，而蜂膠對照組和蜂膠大棗提取物的LPO含量遠低於模型對照組，但高於對照組。實驗證實，蜂膠確實具有清除自由基的作用，通過清除血液中過量的自由基，保護血液，防止氧化造成的損傷。
小鼠註射四氧嘧啶後，腦組織脂質過氧化水平明顯升高，說明腦組織已經受到嚴重的氧化損傷。小鼠食用蜂膠和蜂膠棗提取物後，腦組織中LPO含量明顯下降，說明蜂膠對自由基引起的小鼠腦組織氧化損傷有明顯的保護作用，這可能與蜂膠清除自由基能力強，阻斷多不飽和脂肪酸的鏈式反應有關。自由基誘導衰老後腦組織單胺氧化酶活性明顯升高，這是衰老的特征之壹。給予蜂膠和蜂膠棗精後，腦組織MAO-B活性明顯下降，不僅低於模型對照組，也低於正常對照組，說明蜂膠和蜂膠棗具有確切的抗衰老作用。
9.本實驗還證明，力竭運動對照組和力竭運動給藥組的SOD和GSH-Px活性分別高於相應的安靜對照組和安靜給藥組，因為體內自由基壹直在加速。但力竭運動涉及的兩組SOD活性差別不大，因為兩組產生的自由基相似。力竭運動組的GSH-Px活性低於力竭運動對照組，給藥組的遊泳時間比對照組長得多，間接證明蜂膠棗精具有清除自由基，改善小鼠運動功能的作用。恢復24h後，力竭運動給藥後恢復組的SOD活性高於正常對照組，但低於對照組恢復組，證明蜂膠棗提取物能加速疲勞恢復，其可能原因與蜂膠清除體內自由基有關。
力竭運動後，小鼠血液和肝臟中LPO含量急劇升高。因此，力竭運動對照組和力竭運動給藥組的LPO含量均高於正常對照組，力竭運動給藥組的LPO含量顯著低於力竭運動對照組，表明棗精可通過清除力竭運動產生的自由基，降低過量自由基對生物膜或生物大分子的氧化損傷程度。
恢復24小時後，運動組的LPO含量不僅低於運動恢復對照組，而且接近或低於正常對照組。表明蜂膠棗提取物對阻斷自由基引起的生物膜氧化損傷，加速機體疲勞恢復有顯著作用。
力竭運動後小鼠血糖明顯下降，力竭給藥組高於力竭對照組，安靜給藥組高於安靜對照組。這可能是因為蜂膠中的某些成分促進了血糖的合成。特別是恢復組的血糖含量高於安靜對照組，進壹步說明蜂膠棗提取物可以加速力竭運動後血糖的恢復。
力竭運動後，血紅蛋白含量明顯下降，參與運動的兩組Hb含量均低於安靜對照組。恢復24小時後，力竭恢復藥物組Hb含量高於正常對照組，說明蜂膠棗精中的某些成分促進了Hb的合成，使其過度恢復。
LDH是壹種參與葡萄糖代謝的同工酶，兩組力竭運動中LDH的活性明顯高於正常對照組，說明力竭運動後LDH的活性增加，並伴有大量的乳酸產生，而且力竭運動組的運動量遠大於力竭運動對照組，所以LDH的活性高。恢復24h後，力竭恢復組LDH活性略低於力竭恢復對照組，表明蜂膠棗提取物能促進疲勞的恢復。小鼠的遊泳時間是多種因素共同作用的結果，不僅反映了機體的疲勞能力，也反映了機體的抗應激能力。本實驗結果表明，蜂膠棗提取物能延長小鼠遊泳時間，比對照組延長26.42%，充分說明蜂膠具有抗疲勞和增強體質的作用。
關鍵詞:蜂膠；蜂膠產品；技術研究；抗氧化作用；抗疲勞效果